样品保存条件对乳成分、体细胞和尿素氮的影响
样品保存条件对乳成分、体细胞和尿素氮的影响
 
刘琴1成玉梅2周亚平1张利坤2李春2施开平2
1. 昆明市动物卫生监督所   云南昆明  650041
2. 昆明市奶牛生产性能测定中心   云南昆明  650041
 
摘要：将6个添加了防腐剂的牛奶分成两份，一份保存于常温，一份保存于4℃，常温条件下样品连续测定7天，冷藏条件下样品连续测定8天。结果发现冷藏条件下牛奶较稳定，脂肪、蛋白、乳糖指标在常温保存条件下，最好在四天之内测定完毕，冷藏条件下可保存至少一周；体细胞在常温保存条件下样品最好在3天之内检测完毕，超过3天后体细胞下降达到10万以上，冷藏条件下可以保存至少一周；测定尿素氮，由于尿素氮指标不稳定，不论是常温或是冷藏最好不要超过三天。
关键词：样品保存， DHI，乳成分、体细胞、尿素氮、影响
    近年来，我国奶牛生产性能（DHI）测定工作不断得到深入，参测牛只数量每年呈上升的趋势，一方面是国家对该项工作的重视，不断加大投入；另一方面是奶牛场（奶农）对DHI测定工作重要性认识不断加强，自觉参加测定。DHI测定工作的意义不仅体现在全国层面上的种公牛选育，对于牛场来说更是为奶牛饲养管理提供理论依据和数据支撑，因此其数据的准确性意义重大。昆明市自2009年开始DHI测定工作以来，已累计参测奶牛3万余头，成效比较显著。但是由于牛场分布较广，送样时间较长，为探讨牛奶保存时间对DHI测定结果的影响，为DHI采样工作提供依据，昆明市动物卫生监督所及昆明市奶牛奶业协会通过样品在常温和冷藏条件下连续测定，研究不同保存条件和时间对DHI测定结果的影响。现将其报道如下。
1. 仪器和材料
    1.1 仪器：CombiFoss™ FT+牛奶体细胞成分联机分析仪，水浴锅（北京中兴）。
    1.2 样品：在昆明市晋宁县6个奶牛场共采集6份样品，每份样品1000ml，加入防腐剂（按每50ml加入1粒专用防腐剂，其主要成分溴硝基丙二醇）。样品采集后分成两份，一份存于4℃，一份存于常温。测定前水浴至42℃。分别检测脂肪、蛋白、乳糖、体细胞、尿素氮，连续测定7-8天。
2. 方法
    2.1  仪器校准：脂肪、蛋白、乳糖用奶牛全国畜牧总站DHI标准物质制备实验室提供的标准品定标，每月一次定标。每次检测前用清洗调零，并用校核样检测。体细胞用FOSS公司的FMA校核，尿素氮自校准。
    2.2  样品测定：样品42℃水浴加热25-30min，测定脂肪、蛋白、乳糖、体细胞、尿素氮5个指标。常温保存测定连续7天，冷藏保存连续测定8天。
    2.3  数据分析 用EXCEL 2007 进行数据处理，用SPSS 16.0 进行配对T检验，0.05为显著性判定标准。
3. 结果
    3.1 对脂肪的影响
   常温和冷藏对脂肪的影响不明显。六个样品连续一周测定的值见表1、2。连续测定值与第一天测定结果的T值见表3。从表3可以看出，两种保存条件连续一周测定结果与第一天的T值均大于0.05，差异不显著。常温条件下，脂肪的变化幅度较大，6个样品的连续测定，与第一天的差值平均值从0.06至-0.03，而冷藏条件下，连续测定8天，与第一天的差值都在0.02，差异很小。

3.2 对蛋白的影响
    保存方式对蛋白的影响见表4、5，T值见表6，常温保存条件下，T值均大于0.5，但检测值绝对差较大，如第1号样品在第七天差值达到0.09，第4号样品在第六天差值较大的达到0.23。而在冷藏条件下，第四天、第六天的结果与第一天有显著差异，T值分别为0.025和0.01，而其他日期的T值均大于0.5，但绝对差值较小，均在0.03以内。常温保存条件下，在第四天之内6个样品平均变化均在0.03以内，而在第五天之后，样品平均变化超过了0.04。
表4  常温保存温度对蛋白的影响    单位：%
样品
第一天
第二天
第三天
第四天
第五天
第六天
第七天
1
2.99
2.98
2.98
3
3.04
3.01
3.08
2
3
3
2.97
2.99
3.05
2.98
2.99
3
3.14
3.13
3.12
3.13
3.16
3.07
3.11
4
2.76
2.81
2.86
2.92
2.97
2.99
未测
5
3.05
3.07
3.07
3.09
3.09
3.11
3.05
6
3.23
3.21
3.23
3.24
3.23
3.25
3.2
绝对差均值
 
0.01
0.01
0.03
0.06
0.04
0.06
表5  冷藏对蛋白的影响       单位：%
样品
第一天
第二天
第三天
第四天
第五天
第六天
第七天
第八天
1
2.99
2.98
2.98
3.02
3
3.03
2.98
2.98
2
3
2.99
2.97
3.01
3
3.02
2.96
2.98
3
3.14
3.14
3.11
3.15
3.15
3.16
3.12
3.14
4
2.76
2.76
2.74
2.77
2.79
2.8
2.77
2.77
5
3.05
3.06
3.08
3.07
3.05
3.09
3.05
3.05
6
3.23
3.24
3.25
3.23
3.21
3.25
3.23
3.23
绝对差均值
 
0.00
-0.01
0.01
0.01
0.03
-0.01
0.00

3.3 对乳糖的影响
    保存方式对乳糖的影响见表7、8，T值见表9。常温保存条件下，T值均大于0.5，差异不显著。但从数值上来看，乳糖差异较大，乳糖有降低的趋势。如1号样品第一天第三天相差0.06，与第七天相差达到0.14，而第4号样品第1天与第二天相差达到0.1，与第六天差异达到0.45，可能与样品本身有关。在冷藏条件下，差值较小，连续测定6个样品平均变化值都在均在0.02以内。说明冷藏条件下，乳糖值较稳定。
           表7 常温对乳糖的影响           单位：%
样品
第一天
第二天
第三天
第四天
第五天
第六天
第七天
1
4.74
4.71
4.68
4.72
4.69
4.62
4.6
2
4.68
4.68
4.67
4.68
4.69
4.64
4.66
3
4.62
4.62
4.61
4.63
4.63
4.52
4.58
4
4.53
4.43
4.35
4.34
4.23
4.08
未测
5
4.78
4.81
4.82
4.83
4.84
4.79
4.8
6
4.85
4.81
4.87
4.87
4.84
4.83
4.82
绝对差均值
 
-0.02
-0.03
-0.02
-0.05
-0.12
-0.01
             表8 冷藏对乳糖的影响                单位：%
样品
第一天
第二天
第三天
第四天
第五天
第六天
第七天
第八天
1
4.74
4.74
4.72
4.78
4.72
4.72
4.71
4.75
2
4.68
4.69
4.63
4.73
4.67
4.67
4.64
4.69
3
4.62
4.63
4.59
4.64
4.64
4.6
4.61
4.64
4
4.53
4.52
4.47
4.55
4.56
4.49
4.53
4.52
5
4.78
4.8
4.83
4.84
4.8
4.79
4.78
4.83
6
4.85
4.86
4.87
4.87
4.83
4.83
4.86
4.87
绝对差均值
 
0.01
-0.01
0.04
0.00
-0.02
-0.01
0.02

3.4 对体细胞的影响
    保存条件对体细胞的影响较大，结果见表10 、11，T值见表12。常温条件下，在第三天之内，6个样品的体细胞变化平均值在10万以内，在第四天以后，6个样品变化平均值超过10万，在第五天后，体细胞数与第一天的结果差异极显著（T值小于0.05），体细胞随保存时间延长持续下降，在第七天时下降幅度接近50%，见图1。而在冷藏条件下，体细胞相对稳定，在实验期内T值均大于0.05，差异不显著，连续测定八天绝对差值都在15万/mL以内，6个样品绝对差均值在4万以内。
        表 10 常温对体细胞的影响          单位：万/mL

样品
第一天
第二天
第三天
第四天
第五天
第六天
第七天
1
155
149
121
100
85
80
68
2
145
133
115
109
96
86
80
3
130
134
127
123
115
110
103
4
62
68
63
65
61
54
未测
5
70
78
61
55
52
45
39
6
161
197
180
161
149
140
144
绝对差均值
 
6
-9
-18
-28
-35
-34

             表 11 冷藏对体细胞的影响        单位： 万/mL

样品
第一天
第二天
第三天
第四天
第五天
第六天
第七天
第八天
1
155
170
158
148
153
156
137
140
2
145
147
138
142
147
148
137
137
3
130
150
137
143
146
141
143
139
4
62
62
58
60
57
60
58
51
5
70
68
69
69
74
71
68
71
6
161
160
163
163
158
165
160
161
绝对差均值
 
6
0
0
2
3
-3
-4.00

      
               
3.5 对尿素氮的影响
     保存方式对尿素氮的影响见表13、14，T值见表15。常温条件下，T值均大于0.05，差异不显著，但是尿素氮值忽高忽低，差异较大（1号和5号样品第一天和第三天差异已经达到1.4，6号样品第一天和第三天的差异达到2.5）。而冷藏条件下，第一天和第四天，第一天和第七天T值小于0.05，差异显著，但规律性不强。总体上来说，不论是常温或是冷藏，尿素氮指标值不稳定，采样后要及时检测。
       表13  常温对尿素氮的影响          单位：mg/100mL

样品
第一天
第二天
第三天
第四天
第五天
第六天
第七天
1
5.7
5.6
4.3
7.2
5.3
1.8
0
2
8.2
6.9
9.9
9.3
9
9.4
10.1
3
6.8
6.9
9.4
8.9
10.5
11.4
12.9
4
2.6
0.8
0
0
0
0
未测
5
6.3
6.8
7.6
8.7
6.3
7.4
8.6
6
7.8
8.9
10.3
9.1
9.6
10.2
10.8
绝对差均值
 
-0.2
0.7
1.0
0.6
0.5
2.3

   表14 冷藏对尿素氮的影响         单位：mg/100mL

样品
第一天
第二天
第三天
第四天
第五天
第六天
第七天
第八天
1
5.7
5.3
6.9
7.4
6.1
6.5
5.9
8.1
2
8.2
8.5
7
8.4
8.1
7.4
9.1
10.3
3
6.8
5.9
7
7.6
7.1
6.7
6.9
9.1
4
2.6
3.6
3.7
3.6
2.7
4.4
3.8
4.3
5
6.3
6.7
7.4
6.6
6.5
7
6.8
7.9
6
7.8
8.9
8.3
7.8
8.5
8.5
8.2
9.5
绝对差均值
 
0.3
0.5
0.7
0.3
0.5
0.6
2.0

图2 保存方式对尿素氮的影响

4. 讨论
    4.1  脂肪：常温保存时，第二天脂肪结果升高，6个样品平均差异达到0.06，然后检测值又逐渐下降，规律性不强，差异不显著，可能是样品本身的问题。冷藏对脂肪的影响不大，保存一周之内对检测结果影响在0.03之内。
    4.2  蛋白：常温保存情况下，连续测定七次，与第一天的T值都在0.05以上，常温保存时，蛋白质在第五天6个样品的差异平均值达到0.06，说明保存期超过第五天以上时，差异较大。而冷藏保存条件下，第四天、第六天的结果与第一天有显著差异，T值分别为0.025和0.01，但考虑第五天、第七、八天的差异不显著，连续测定8天差异平均差异都在0.03以内，说明差异可以忽略不计。
    4.3  乳糖：常温保存时，连续测定七天T值都在0.05以上，但是第五天之后6个样品差异平均值达到0.05。而冷藏保存条件下，虽然在第三天时，差异极显著，但随后的几天内，T值均大于0.05，连续测定8天6个样品平均差异都在0.02以内，说明差异来自于样品本本身。
    4.4 体细胞：常温保存时，在第二、三天，体细胞差异都在10万以内，在第四天后，6个样品差异平均值都在10万/mL以上，且在第五天后体细胞与第一天的T值都小于0.05，说明体细胞变化显著。而冷藏条件下，连续测定8天6个样品平均变化都在5万以内，说明冷藏条件下可以保存一周以上。
    4.5 尿素氮：不论是常温或冷藏，尿素氮测定值不稳定，规律性不强，忽高忽低，原因尚不明确。常温条件下，保存至第七天，尿素氮平均变化超过2.0，冷藏条件下，保存至第八天，尿素氮变化也超过2.0。
5 结论
    5.1常温保存样品稳定性不如冷藏条件，因此样品采集后尽量冷藏保存。检测脂肪、蛋白、乳糖时，如果常温保存，最好在第四天之内测定，如果需要长途运输要有冷链措施。冷藏条件下至少可以保存8天以上。
    5.2 测定体细胞时，常温对体细胞的影响比较大，随时间延长，体细胞数下降，冷藏条件下也如此，但下降幅度较小。检测体细胞时，常温保存样品要在3天之内检测，冷藏条件下可以保存至少一周。
    5.3  测定尿素氮时，由于其很不稳定，样品采集以后最好能在第二天内测定完毕。超过3天，尿素氮指标变化可能会较大，导致结果不准确。