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    胚胎移植

    (上传时间:2009-11-20 9:18:02 文章来源:现代乳牛学  浏览次数  打印收藏

  •      胚胎移植也称为受精卵移植,是将一头良种母牛配种后的早期胚胎用冲洗子宫的方法取出,或是经体外受精获得的胚胎,移植到另一头同种的、生理状态相同的母牛体内,使之继续发育成为新个体,通俗称为“借腹怀胎”或“人工受胎”。提供胚胎的个体称为供体,而接受胚胎的个体称为受体。

      胚胎移植产生的后代的遗传特性受供体母畜和与之交配的公畜决定,而受体母畜只提供其胚胎发育期间的营养。因此,胚胎移植在充分发挥优良高产奶牛的繁殖潜力,提高繁殖效率,加速牛群品种发育,诱发母牛产双胎,扩大良种牛群等方面具有重要重义。另外也是胚胎生物工程技术实施的重要手段。

    牛胚胎移植的主要技术环节包括:供体、受体的选择,供体、受体的发情同期化,超数排卵,胚胎的采集,胚胎检查、质量鉴定,胚胎冷冻保存和胚胎移植。牛胚胎移植技术程序见上图。

      (1)供体、受体母牛的选择

      ①供体母牛的选择:选择具有较高的种用价值,遗传性能好,身体健康,无生殖器官疾病,发情周期正常,生殖机能处于较高水平,年龄在3—10岁的经产母牛。

      ②受体母牛的选择:受体牛仅作为借腹怀胎,不要求遗传性状,但发情周期必须正常,生殖器官无疾病,体形大且健康,可用廉价低产的青年奶牛或黄牛作受体。

      (2)供体、受体母牛的发情同期化处理  由于在发情周期内,母牛的生理变化很大,供体和受体的生理状况要趋于一致,否则移植后的胚胎不能存活。因此,要求供体、受体母牛在发情时间上要相同或相近,前后不宜超过1天。由于在生产中难以选择到与供体发情时间相同的足够数量的自然发情的受体,所以一般情况下要对供体和受体进行同期发情处理。

      (3)供体母牛的超数排卵  一般情况下,母牛的一个发情周期中只排出一个成熟的卵子。为了提高良种母牛的利用效果,要对供体母牛进行超数排卵处理。超数排卵是利用外源促性腺激素,增进卵巢的生理活性,比在自然情况下,激发多量卵泡在一个发情期中成熟排卵。主要使用促卵泡素(FSH)或孕马血清促性腺激素(PMSG)和前列腺素(PG),以及促黄体素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)等进行处理。

      几种超数排卵的方法:

      ①促卵泡素+前列腺素F2α  (一般用氯前列烯醇)在发情后的第9~13天进行,肌注促卵泡素50毫克,肌注或子宫注入前列腺素F2α 4~5毫克(子宫注入量减半)。促卵泡素处理采用递减法,以7毫克、6毫克、5毫克、4毫克、3毫克递减,每日分上、下午2次注射,共连续注射5天。在第3天与注射促卵泡素同时注射前列腺素4~5毫克,第5天下午进行第一次输精,第6天上午做第2次输精。

      ②孕马血清促性腺激素+前列腺素F2α  用药时间同上,孕马血清促性腺激素肌肉注射1500—3000国际单位48小时后,肌注或子宫注入前列腺素F2α  4—5毫克。输精时间在前列腺素处理后48小时,每隔10~12小时输精1次,共输2—3次。

      (4)胚胎的收集  胚胎收集指的是利用冲卵液将早期胚胎从供体母牛的子宫角内冲出来,并收集于一定的器皿中。胚胎收集方法有手术法和非手术法两种,现普遍采用非手术法。一般在供体母牛发情配种后6~7天内收集胚胎,胚胎处于致密桑椹期和囊胚期。此方法简便易行,对生殖道的损伤的危险性小,收集效果比较好。

      首先将供体牛保定,体位前高后低,便于操作和胚胎冲出。尾根处(第3—4尾椎)剪毛,酒精消毒,注射2%普鲁卡因2~3毫升或2%~4%盐酸利多卡因2~4毫升等进行尾椎硬膜外麻醉。如牛不安宁可肌注2%静松灵2—4毫升。直肠检查卵巢大小、子宫状况,估计黄体数量。清洗外阴部,用消毒液消毒。

      非手术冲取胚胎所用的冲卵管有二路式和三路式,其不同之处是冲卵液注入和导出的管道,二路式是同一管道,而三路式则各有进出两个管道。另外两种冲卵管都有一注入空气的管道,使之冲卵时,可将子宫角内腔基部固定。但气囊充气应适度,过于膨胀易损伤子宫内膜,过小则不能固定冲卵管,使子宫留有间隙,冲卵液由阴道流出。

      一般每侧子宫角需冲卵液500毫升,冲卵液温度保持在37~C,冲卵液的导出应顺畅,进出液量要相当,因此,操作时,可用手隔着直肠壁将子宫提高,促进液体回流。收集到的冲卵液,置于37~C无菌间待检。收集胚胎的冲卵液目前多采用改良的杜氏磷酸缓冲液(mPBS),此液可用于冲洗胚胎,也可用于胚胎的保存液和培养液。配制方法简单,成本低,比较适用。

      (5)胚胎的检查和级别划分  将收集到的冲卵液静止10~30分钟,待胚胎下沉后,将上层液吸出,剩余的沉淀液体(约50毫升)分别倒入几个检卵杯中,置于体视显微镜下将胚胎检出。检查时要求仔细快捷,不要丢失胚胎,在30分钟以内检查完毕,以防显微镜光源温度高,而使载物台温度上升,从而影响了胚胎质量。

      将收集到的胚胎,置于高倍镜下观察其形态和发育时期。正常发育的胚胎,卵裂球整齐清晰,大小较一致,分布均匀而紧密,透明带完整,发育速度与胚胎日龄相一致。而没有受精、透明带内卵裂球异常、透明带破损等为不可用胚胎。

      目前对胚胎的质量鉴定基本上采用形态学的方法,将胚胎分为A级(优秀胚)、B级(良好胚)、C级(一般胚)、D级(不良胚)四个级别。其中,A级和B级胚胎为移植可利用胚胎。

      A级:发育形态正常,卵裂球致密、整齐、清晰,发育速度与日龄一致。

      B级:卵裂球稍微不匀,比较致密、整齐,有个别卵裂球游离。

      C级:卵裂球不十分匀称,变形,发育较慢。

      D级:卵裂球多数变形、异常,发育缓慢。

      (6)胚胎的移植  牛的胚胎移植方法有手术和非手术移植两种,目前多采用非手术移植法。使用特制的胚胎移植器,通过阴道和子宫颈,将胚胎注入到子宫角的一定部位。其操作过程如下:

      ①受体牛的保定和消毒:与供体牛处理方法相同。

      ②胚胎的洗涤和封装:将鉴定的优良胚胎用新鲜的保存液洗涤2~3次,以除去附着的黏液、杂质等,然后将胚胎封装于0.25毫升的塑料细管中。封装时,先在细管内吸入保存液大约5厘米长度,然后使管内形成0.5厘米的空气层,再吸入含有保存液的胚胎大约2.5厘米长度,再形成0.5厘米的空气层,最后吸入保存液直至管端。胚胎装入后,必须将细管放在显微镜下检查,以确定胚胎是否在管中。

      ③移植胚胎:将封装好胚胎的细管,开口一端(远离棉芯的一端)向内装入移植器中。直肠检查受体牛卵巢排卵一侧的黄体质地,通过直肠把握子宫颈,将移植器送入子宫颈,再直肠把握子宫角,把移植器轻轻推入有黄体一侧的子宫角,并使其深入到子宫角的大弯部,随后将胚胎推入并缓慢取出移植器。操作时注意动作要稳、快、移植部位要准确,移植后检查细管,看有无胚胎遗漏。如有遗漏,则需重新移植。

      (7)供体和受体的术后观察  胚胎移植后要注意观察供体和受体的健康状况和在预定的时间内是否发情。对于供体牛,在下一次发情即可配种,如仍要做供体则一般要经过2—3个月才可超排卵。对于受体牛,如移植后发情,则表明移植失败,可能胚胎丢失、死亡、吸收或有缺陷,也可能是受体牛的子宫环境不相适宜;如未发情,也要继续观察3~5个情期,并在适宜时期进行妊娠诊断。

     

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